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电泳实验技术原理

电泳实验的技术原理

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电泳是带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。

带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度。

电泳时，带电颗粒（球形）在介质中受力平衡匀速运动，则有：

v = F阻/f = FE/f = E·q/f = E·q/(6π·r·η)

v — 泳动度 F阻 — 颗粒所受阻力

E — 电场强度 q — 颗粒所带电荷

r — 颗粒半径 η — 介质黏度

FE — 颗粒所受电场力 f — 摩擦系数

由上式可见：泳动度与球形分子半径、介质粘度、颗粒所带电荷以及电场强度有关。 非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动度与粒子形状有关。

DNA电泳

DNA电泳常见问题分析及解决方案

DNA条带模糊：1，DNA降解避免核酸酶污染；2，电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液；3，所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力；4， DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量；5，DNA样含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐；6，有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白；7，DNA变性电泳前勿加热，用20mM N***缓冲液稀释DNA

不规则DNA条带迁移：1， 对于λ/Hind III片段cos位点复性电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟；2，电泳条件不合适电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液；3，DNA变性以20mM N*** Buffer稀释DNA，电泳前勿加热

带弱或无DNA条带：1，DNA的上样量不够增加DNA的上样量；聚酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低；2， DNA降解避免DNA的核酸酶污染；3，DNA走出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度；4，对于EB染色的DNA，所用光源不合适应用短波长（254nm）的紫外光源

DNA带缺失：1，小DNA带走出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度；2，分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度；3， DNA 变性电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM N*** Buffer稀释DNA；4，DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适 在脉冲凝胶电泳上分析

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转印电泳的一抗和二抗

转印电泳的一抗和二抗

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一抗孵育：将LG用稀释液稀释到适当的浓，在摇床上孵育2h（如果做过预实验后发现条带较淡，可以适当降低一抗稀释度或者延长一抗孵育时间）

洗膜：用PBST或者TBST洗膜5 X 5min，如果预实验中发现背景过高，可以增加洗膜时间或洗膜次数

二抗孵育：二抗是辣根过氧化物酶(HRP)标记的LG, 摇床上孵育2h（如果做过预实验后发现条带较淡，可适当降低延长二抗孵育时间）

洗膜：用PBST或者TBST洗膜3 X 10min

T：Tween-20（去污剂）